国内分子诊断主要技术

（一）国内比较有特色的技术

一步法PCR检测技术

“一步法PCR检测技术”是国内一项具有自主知识产权的在国际上也是独有的技术，利用快速核酸释放技术，省去了加热、离心、移液、换管等操作，样本处理时间比同类产品大大缩短。样本处理与PCR扩增在一个PCR反应管中即可完成，只需微量样本即可实现高灵敏度检测，不但检测成本低，大大降低了对操作人员的要求，易于分子诊断的应用普及，利于自动化大批量样本处理，适合大型疾病如HBV、HPV筛查等应用。同时一步法技术可以给分子诊断的即时检测平台（POCT）提供最简洁快速的核酸检测方案，极大的简化检测装置和流程，确保分子诊断即时检测平台的移动性和时效性，在家用检测、危急病人实时检测、重大疫情的防控有着独特优势。

带磁珠扩增的磁珠法PCR检测技术

对比于传统的煮沸法，柱提法等核酸提取技术，国内自主开发的国际领先的第五代磁珠法核酸提取技术，通过超顺纳米磁珠富集样本中的核酸分子，在常温下裂解病原体，无需加热煮沸、离心，磁珠不需洗脱核酸，可带磁珠进行PCR扩增，简化操作步骤，灵敏度高、线性范围宽、可重复性好、抗干扰能力强，可实现自动化的PCR定量检测。在乙肝检测方面，灵敏度可达到国际领先的5-10 IU/mL，满足临床对病毒性肝炎感染进行早期诊断、病毒学应答、耐药监测、疗效观察及预后评估的需求。

集成自动化及微流控技术

体外诊断的自动化目前主要技术为机械手臂和微流控技术两类。这两类仪器各有特色和优势，活跃在不同的应用场景。基于微流控技术的体外诊断仪器往往全自动化集成，操作也比较简易。但是，相对机械手臂式的仪器而言，单个样品检测成本可能会较高。国内开发了集成全自动化机械臂和微流控芯片技术用于分子诊断的产品，利用机械臂的精准移液操作，并结合微流控技术制备的检测芯片，可以实现全自动化的核酸提取、扩增、杂交检测全过程，实现sample-to-answer的检测模式，同时可实现样本的多重检测。基于该模式，可以完成对病原体多型别的检测，比如HPV分型检测。

Super-ARMs PCR技术

突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）是目前国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最广泛应用的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。厦门艾德自主研发的“Super-ARMS”是ARMS技术的升级版，保留了ARMS技术简便、快速、特异性好、易普及等特点，同时进一步提高检测灵敏度（灵敏度可达0.2%），用于临床检测晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者血液ctDNA中EGFR基因突变状态，筛选适合接受一代至三代EGFR靶向药物治疗的患者。

(二) 自动化核酸提取技术

核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器，目标用户通常为对标准化、质量改进和对自动化感兴趣的分子诊断和研究实验室，涉及核酸提取实验的小型、中型和大型实验室。最早将全自动核酸提取仪投入到市场的是罗氏公司，近几年来，开发核酸提取仪器的厂家如雨后春笋，国内的厂家主要有达安、圣湘、天隆、之江、安普利，国外的厂家有罗氏、雅培、凯杰、珀金埃尔默等。2017年市面上的各种核酸提取仪器得到了非常大的应用和推广。

按照核酸提取仪的功能大小，核酸提取仪分为两类：一类是大型的全自动化的核酸提取仪，一般称为自动液体工作站，样本试剂全部加在仪器上自动化处理；另一类是小型自动核酸提取仪，也称半自动核酸提取仪，利用封装好的配套试剂，手动加入样本，然后放置在仪器中自动完成提取纯化过程。自动液体工作站是功能比较全面的设备，液体分液、吸液等自动完成，有的甚至可以整合扩增、检测等功能，做到了样本进结果出，一次提取的样本量非常大，一般提取的通量在96个到几百个标本不等。小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊设计达到自动提取核酸的目的，仪器设备和运行成本低，操作简单方便，一次提取24-48个样本不等。目前临床检验医学检测样本类型主要有血清、血浆、分泌物、脱落细胞、咽拭子、肛拭子、尿液、粪便、痰液、全血、组织、石蜡切片等十多种，不同的分析系统和试剂的核酸提取操作方式不一致，导致临床操作繁琐，容易出现操作误差，影响临床报告的准确性。国内有厂家率先开发了一种统一提取试剂，在其自动液体工作站上可以同时提取多种样本类型，简化核酸提取的操作，为下游的应用揭开了广阔的前景。

(三) 数字PCR

20世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR(digital PCR，dPCR)的概念，即通过将一个样本分成大量等份，然后分配到不同的独立反应，每个独立反应单元至少包含一个拷贝的目标分子(核酸模板)，在每个独立反应的中分别对目的模板分子进行PCR扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。

当前数字PCR主要采用微流控芯片或微滴化方法，将核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴反应单元中，每个反应的核酸模板数少于或者等于1个。经过PCR之后，含有核酸分子模板的反应就会产生荧光信号，没有模板的反应就没有荧光信号。根据相对比例和反应单元的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。目前数字PCR主要在癌症标志物稀有突变检测、致病微生物检测、基因表达分析以及拷贝数变异分析等科研领域有较广泛的应用，同时也可以与高通量测序无缝对接，验证测序结果。

2017年4月21日，国家食品药品监督局同意南京科维思公司的芯片式数字PCR分析系统进入新一批创新医疗器械特别审批申请项目名单（“绿色审批通道”）。该款产品有望率先获得国家食品药品监督管理局认证，成为国内首款基于数字PCR的临床级检测产品。

(四) 国内测序技术

2017年，国内厂家新推出了GenoCare、MGISEQ-200、MGISEQ-2000等几款国产测序仪。2017年1月，国家食品药品监督管理局批准了DA8600高通量基因测序仪适应范围变更，由原来的“仅用于胎儿染色体21三体、18三体、13三体的非整倍体检测”扩展为“用于胎儿染色体21三体、18三体、13三体的非整倍体检测，人体基因位点的检测”。2017年03月，国家食品药品监督管理局批准了基因测序仪NextSeq 550AR和胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（可逆末端终止测序法）的医疗器械产品注册。2017年12月，BGISEQ-50基因测序仪获得国家医疗器械注册证。

2017年11月，北京大学黄岩谊教授团队开发了一项被称为ECC（Error-Correction Code）测序的新技术，发表在Nature Biotechnology上。该技术是基于信息理论来修正错误的高准确度荧光DNA测序方法，将使高通量测序仪的精准度进一步大幅提升。通过实验室样机的测试，测序读长可以达到250bp，其中前200个碱基的准确率可达100%。这一新型测序仪创造性地结合了“荧光发生”和“纠错编码”技术，测序结果将具有更精准、更高效、更经济的显著特点，将为国产高端医疗设备制造和市场应用带来新鲜血液。

2017年，国产BGISEQ-500平台的通用测序仪及其配套试剂、NIFTY检测试剂盒及核酸提取试剂盒均获得了欧盟医疗器械CE Mark认证。这意味着由中国智造的高通量测序仪及其产品满足了欧洲体外诊断器械相关指令的法规要求，有望获得更多推广。

(五) 微生态研究

按照正常微生物群所占的空间不同，人类微生态系统分为以下几类，即人类口腔微生态系统、胃肠道微生态系统、泌尿道微生态系统、生殖道微生态系统、皮肤微生态系统、呼吸道微生态系统。其中肠道微生态与疾病的相关性研究成为2017年的科研热点，已经报道了肠道细菌多样性与克罗恩病、糖尿病、心脑血管病、结直肠癌等疾病具有很高的相关性，例如在结直肠癌患者的肠道中能特异性的检出具核梭杆菌含量增高。同时也有研究报道显示肠道细菌菌群构成与癌症的用药治疗、化疗效果具有相关性，为癌症的个体化治疗提供一个新思路。不过目前肠道微生态的临床研究还处于科研阶段，仍然需要更多数据支撑来明确临床诊断的意义。

2017年6月20日，《Nature Medicine》刊文关于发现抑制肥胖的肠道微生物——多形拟杆菌。上海交通大学瑞金医院的宁光院士、王卫庆教授团队，以中国的汉族年轻人为研究对象,研究发现肥胖人群中谷氨酸的含量非常高，与苗条人群形成显著差异，并且在肥胖人群中谷氨酸的含量与多形拟杆菌的数量呈反比。通过对小鼠移植多形拟杆菌的动物实验，以及分析23名接受过袖状胃切除术的志愿者的肠道微生物得到进一步验证，从研究上预示着通过肠道微生物来治疗肥胖是可行的。

(六) 无创产前单基因病检测技术

随着高通量测序技术的发展及推广，无创产前基因检测技术（NIPT）在临床上得到了广泛的应用，为唐氏综合症等染色体变异的筛查提供了精准、便捷的解决方案。但NIPT技术仅筛查染色体层面的变异检测，而不涉及导致出生缺陷的另一大类因素---单基因遗传病，单基因病种类繁多，综合发病率高，对人类健康造成严重损伤（致死、致残或致畸），而且缺乏有效诊治手段，一旦发生会给社会以及家庭造成沉重的负担。

为解决无创产前单基因病检测方面的技术缺陷，香港中文大学卢煜明教授与美国新型测序公司10X Genomics联合，应用10X Genomics的Linked Read技术对父母双方基因组单倍型分型，并对单基因病突变位点附近有效单核苷酸多态性（SNP）进行区分，之后通过对母亲外周血DNA进行测序，推断胎儿是否存在相关遗传突变。该技术可以对单基因病进行无创产前检测，可以用一种方法完成对多种单基因病的检测，是无创产前基因检测技术应用的一大突破。

(七) 感染病原体测序

感染性疾病的病原种类繁多，传统的血清学、培养等手段在鉴定感染性疾病的病原方面耗时费力，难以及时的给临床提供可靠的诊断依据，使得不少感染性病患者未能得到及时有效的治疗，导致预后不良。国内公司采用高通量宏基因组测序技术对病原体感染患者提供基因检测，通过微生物专业数据库比对和智能化算法分析，获得疑似致病微生物种属信息，可以为疑难危重感染患者提供快速精准诊断依据，促进抗生素合理使用。该检测可协助临床快速鉴定并明确患者的感染病原体，特别是对未知或者无法培养的病原有独特优势。对感染病原体进行定性定量的同时，实现病原体基因组变异的检测，研究病原体随时间的变异情况，有助于疫情起源追踪与疫情监测，可以发现新的病原体，是院内感染控制和社区感染暴发调查的有力手段。

来源：《中国体外诊断产业发展蓝皮书》